【发酵基础】常用灭菌、消毒、除菌和防腐方法及其特征

孟想成真

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染菌与控制是发酵圈永远绕不开的话题。降低染菌率是每一个发酵人应该认真学习和考虑的问题。而合理的应用灭菌、消毒和防腐方法是我们必备的技能。这也是我们在详细介绍发酵过程染菌防控之前需要介绍的内容之一。
2022年八月修订版

在这里仅仅总体介绍方法，使大家有一个整体认识，具体的使用注意事项会在染菌防控章节进行介绍。


01
PART
有害菌控制分类
一般根据是否能将微生物杀灭完全以及杀灭程度，将有害微生物控制分为灭菌、消毒、除菌和防腐。

02
PART
灭菌


灭菌（sterilization）：采用强烈的化学或者物理方法杀灭目的物种的一切微生物,包括芽孢。
（1）火焰灭菌法
干热灭菌法顾名思义就是用火焰的温度来灭菌，在微生物和发酵工业中经常使用，比如我们超净工作台中的酒精灯，比如我们火焰接种用的火焰圈等等。火焰灭菌方法简单，没有什么仪器要求，灭菌彻底，但是使用范围非常有限。
（2）干热空气灭菌法
干热空气的穿透力较弱，因此必须保持长时间的灭菌，灭菌温度也应该相应增加，通常可选择：135-140℃，3-5h；160-170℃，2-4h；180-200℃ 0.5-1h。适用于金属和玻璃器皿的灭菌。
（3）煮沸灭菌法
100℃保持5-10min，可以杀死所有营养体，1-3h，可以杀灭芽孢。发酵工业中并不常用。
（4）间歇蒸汽灭菌法
对于不耐高温的营养成分灭菌可以采用间歇灭菌法，一般常压蒸汽灭菌1h，灭菌温度不宜过高，然后降温，待芽孢萌发后再次灭菌。重复3次，可以达到灭菌的效果。
（5）高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌是我们发酵工业中应用最为广泛的方法。一般0.1MPA，121℃，灭菌20min，115℃灭菌30min，即可实现灭菌的目的。灭菌温度和灭菌速度相关，呈反比的关系，当提高灭菌温度时，灭菌时间也就可以相应缩短，并且随着温度的升高，菌体的死亡速率远远大于营养物质的破坏速率，这就是高温瞬时灭菌的原理，同时也使得连续灭菌可以实现。高压蒸汽灭菌操作有很多细节之处需要注意，不在这里展开，会在公众号有害菌防控中详细说明。
（6）紫外线灭菌法
   是指用紫外线照射杀灭微生物的方法。

• 紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。杀灭一般细菌繁殖体时，应使照射剂量达到 10000 uW.s/CM2；杀灭细菌芽胞时应达到100000 uW.s/CM2；病毒对紫外线的抵抗力介于细菌繁殖体和芽胞之间；真菌抱子的抵抗力比细菌芽胞更强，有时需要照射到以对600000 uW.s/CM2；在消毒的目标微生物不详时，照射剂量不应低于100000 uW.s/CM2。
  
• 一般用于灭菌的紫外线波长是200~300nm，灭菌力最强的波长是253.7nm。紫外线的灭菌能力和紫外线强度和时间成正比，和距离的平方成反比。离地面2米的30W灯可照射9平方米房间，每天照射2－3小时，期间可间隔30分钟。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5米照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米，照射时间30分钟为宜。
  
• 紫外线的杀菌力，随使用时间增加而减退，一般使用时间达到额定时间70%时应更换紫外线灯管，以保证杀菌效果。国产紫外线灯平均寿命一般为2000h。
  
• 紫外线作用于细胞DNA，使DNA 链上相邻的嘧啶碱形成嘧啶二聚体（如胸腺嘧啶二聚体），抑制了DNA复制。另外，空气在紫外线照射下可以产生臭氧，臭氧也有一定的杀菌作用
  
• 紫外线的杀菌作用随菌种不同而不同，杀霉菌的照射量要比杀杆菌大40~50倍。
  
• 紫外线的穿透能力较弱，因此适合空间和物体表面灭菌。
  
• 紫外线照射通常按相对湿度为60%的基础设计，室内湿度增加时，照射量应相应增加。
  
• 紫外线对人体照射过久，会发生结膜炎，红斑及皮肤烧灼等现象，故一般在人入室前开启紫外线灯1~2小时，关闭后人才进入洁净室。如果必须在人进去后仍要开紫外线灭菌，则人的皮肤及眼睛应有有效的防护措施。一般在6~15m3的空间可装置30瓦紫外线灯一盏，离地面2.5~3m为宜。
  

（7）微波灭菌法

微波是指频率在30~3000MHz之间的电磁波。水可强烈地吸收微波，使其极性分子转动，分子间的磨擦而生热，且升温迅速，靠热力而灭菌。在数十秒至几分钟之内可达100～150℃，并全部杀死液体中的微生物，适于水溶性注射液的灭菌。另外，固体药材饮片及固体制剂（丸剂、散剂、胶囊粉等）也含少量水分，微波能穿透到固体内部，由表至里被均匀加热，而起干燥、灭菌的作用。多用于口服液体制剂的灭菌，有望用于注射液的灭菌。但可能对某些药品的PH值、含量、颜色有影响。

（8）其他辐射灭菌法
辐射灭菌是应用γ射线、β射线杀灭细菌的方法，又称电离辐射，前者由钴-60或铯-137发出，穿透力强；后者由电子加速器产生，带电荷，穿透力弱，灭菌效果差。
（9）化学灭菌法
化学灭菌法系指用化学药品来杀灭微生物的方法。同一种化学药品的低浓度时呈现抑菌作用，而在高浓度时则能起杀菌作用。其杀菌机理可能是：能使微生物蛋白质变性死亡，或与酶系统结合影响代谢，或改变膜壁通透性使微生物死亡等。常用的方法有消毒剂消毒法和化学气体灭菌法等。

• 环氧乙烷灭菌法
  

环氧乙烷灭菌法是利用环氧乙烷气体进行杀菌的方法。它是一种传统的灭菌方法，可应用于工衣灭菌、不耐加热灭菌的药品、医用器具、设施、设备等的灭菌。环氧乙烷灭菌系统，主要有下列四项互相制约的重要因素影响灭菌效果：温度、湿度、气体浓度、灭菌时间。因为环氧乙烷是易燃易爆物质，明火可以引起燃烧，同时由于气体分解还可能引起爆炸，环氧乙烷灭菌中应十分注意安全问题。

• 甲醛等蒸汽熏蒸法
  

采用甲醛、丙二醇或过氧醋酸等化学品，通过加热产生蒸汽进行空气环境灭菌。

• 计算房间体积，按10g/m3的比例称出甲醛。
  
• 将甲醛倒入甲醛发生器或加热盘或烧杯中，并放好加湿用水，必要时还需加入高锰酸钾（2~3g/m3），然后加热（甲醛发生器用蒸汽加热，加热盘或烧杯用热水盛入其中加热）使其蒸发成气体。
  
• 灭菌流程：空调器停止运转→启动甲醛气体发生器或在加热盘中加热甲醛→让甲醛气体扩散约30分钟→启动空调器让甲醛气体循环约30分钟→停止空调器，房间熏蒸消毒，时间不少于8小时→房间排气，用新鲜空气置换约2小时→恢复正常运行。当相对湿度在65%以上，温度在24~40℃时，甲醛气体的消毒效果最好。
  

灭菌程序建立后，如需要，可对灭菌程序进行生物指示剂验证实验，以确保其灭菌效果，对于不受高温影响的物质可以采取过度灭菌的方法。



03
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除菌
除菌（degerming）通过某种手段和方法将有害菌排除在目的介质和空间外，并不会杀灭或抑制微生物的生长。在这里我们主要介绍两种方法①过滤除菌②正压除菌。

这两种方法都是采用阻断的形式不让微生物进入我们的培养基，工作空间内。在发酵工业中也是经常用到的。例如：无菌空气的制备，用到的滤芯；生物素过滤除菌用到的液体滤芯；洁净间超净工作台用到的空气滤网；喷雾干燥进气用到的滤网；过滤器必须有一定的稳定性和高效性，在发酵工业中，在线过滤器还需要能够耐受高温，以方便蒸汽灭菌。微生物实验室，P级试验等用到的正压系统；发酵罐的正压维持。这些都是利用过滤除菌和正压除菌保证空间和物料中不含有仍和微生物。

04
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消毒
1. 消毒简介


消毒（disinfection）:利用物理或者化学方法杀死目标物种的所有病原微生物营养体的措施，并不一定能够杀死芽孢行业非病原微生物。消毒方法比较多，比如75%的乙醇和异丙醇，84消毒液，巴氏消毒，0.04~0.1%的新吉尔灭，3%过氧化氢等。
消毒是指杀死病原微生物的方法，包含化学和物理方法。化学消毒剂大多仅能杀死微生物的繁殖体而不能杀死芽孢，能控制一定范围的无菌状态。可将消毒剂配成适宜浓度，采用喷淋、涂擦或浸泡等方法对物料、环境、器具等进行消毒。常用的化学消毒剂有0.1%～0.2%苯扎溴铵溶液、3%～5%的酚或煤酚皂溶液、75%乙醇等。常用于物体表面灭菌。但要注意其浓度不要过高，以防止化学腐蚀作用。洁净室的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、车、桌、椅等表面以及人体双手（手套）在环境验证及日常生产时，应定期清洁并用消毒剂喷洒，无菌室用的消毒剂必须在层流工作台中，用0.22μm的滤膜过滤后方能使用。物理消毒方法，最常用的就是巴氏消毒，采取低温的方法杀灭大多数有害菌的营养体。

（1）臭氧消毒法
臭氧（O3）的消毒原理是：臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧（O2）和单个氧原子（O），后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用，臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将其杀死。多余的氧原子则会自行重新结合成为普遍氧分子（O2），不存在任何有害残留物，故称为无污染消毒剂。它不但对种种细菌（包括肝炎病毒、大肠杆菌、绿脓杆菌及杂菌等）有极强的杀灭能力，而且对霉菌也很有效。

（2）75%的乙醇消毒

我们在进行无菌操作时，经常用到75%乙醇消毒，75%乙醇消毒方法使用比较简单，不多做赘述。需要知道的是为什么要用75%的乙醇：当你用纯酒精消毒时，由于酒精的 浓度很大，很快使细菌表面的蛋白质凝固，结果形成一层硬膜，这层硬膜对细菌有保护作用， 防止酒精进一步渗入，所以，浓酒精反而不如稀酒精。在酒精里掺些水，酒精的浓度就变稀 了，稀酒精并不急于使细菌表面的蛋白质凝固，而是渗入到细菌体内，然后把整个细菌体内的蛋白质凝固起来，从而达到杀菌的目地。我们在超净台中用酒精擦拭双手就是用到了该方法。


消毒剂能够使得病原微生物含量在4-10min内下降5个对数单位（99.999%），或者在30s内下降3个对数单位（99.9%）



3.微生物对消毒剂敏感程度

一般认为微生物对消毒因子的敏感程度从高到底分别为：亲脂病毒、细菌营养体、真菌、亲水病毒、分支杆菌、芽孢、朊病毒。敏感度越低，消毒效果越低。根据杀毒能力可以将杀毒剂分为低效、中效、高效三类。

4.影响消毒剂杀菌效果的影响

一般情况下温度越高，消毒效果越好；有机物会对菌体起到一定的保护作用，影响消毒效果；表面活性剂和金属类离子会在一定程度降低某些消毒剂的效果，使用时适当增加浓度；

5.消毒剂的作用原理
（1）使蛋白变性凝固，金属盐，酸碱，乙醇等；（2）破坏细胞膜，二氧化氯、过氧乙酸等（3）阻断营养摄取和废物代谢，季铵盐类。





05
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抑制
“抑制”很少被提及到，但是在发酵工业中我们总会有意无意的用到这一手段。
根据我们生产菌株的特性，来调整发酵条件，使其有利于生产菌株生长，而减少有害微生物的增值，例如：
（1）pH的控制，在固态发酵时，我们经常采取较低的pH，这样能减少霉菌和其他有害菌的生长。
（2）抗生素的使用，在液态发酵，特别是种子阶段，针对生产菌株的抗性，我们会加入相应的抗生素，来抑制其他微生物的生长。
（3）生长优势，提高接种量，迅速建立生产菌株的优势，从而抑制其他微生物生长，减少染菌几率。
（4）产品防腐剂的使用，在一些产品中国会加入防腐剂，以增加保质期。

发酵工业中会同时用到以上多种防控技术，我们在工作中遇到染菌时，应该从多方面考虑，综合采取多种措施。
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