你还搞不懂设备和试剂如何灭菌吗？

孟想成真

设备与液体的灭菌
所有培养过程中接触到的设备和液体都要进行灭菌，灭菌方法的选择主要取决于物品在高温下的稳定性。通常情况下，如果物品可抗高温，如金属、玻璃、耐热的塑料(如PTFE)，最好采用干热灭菌，稳定的液体采用蒸汽灭菌，热敏感的塑料制品要用射线或乙醇处理，热不稳定的通常使用过滤灭菌。
灭菌方法

1. 干热灭菌
这是最简单有效的方法之一，这种方法可以使所放置物品的所有部位在灭菌过程中都达到正确的温度。这需要监测，将温度探头放在物品的中央，置于灭菌物品的一个副本中(参见图4.17b)。温度必须保持在160℃(320F)至少1h，所以干热灭菌仅限用于玻璃制品、金属制品及抗热的塑料制品，如聚碳酸酯和PTFE。纸和无菌指示胶带可能会焦糊，产生挥发性产物，最好避免，使用非挥发性指示器更好。
2. 压力-蒸汽灭菌
利用加压蒸汽灭菌(或称湿热灭菌)也是一种高效的方法，可应用于热稳定的液体，如水、盐溶液或一些特殊配方的培养基，需要在121℃至少放置20min。如果在密闭的容器中进行，如硼硅酸盐玻璃，就不会有蒸发，但瓶子有爆炸的危险，所以通常要将瓶盖拧松，在完成了包含必要的冷却周期的灭菌程序后，再将盖子拧紧。蒸发量需要监测，如果必须保证物品使用时处于无菌的环境，就要使用无菌的超纯水(UPW))补充。高压锅中应使用蒸馏水、去离子水，或反向渗透水【半纯化水(SPW)】以减少来自高压锅凝结水的污染。
对于干燥的物品，如试管、棉签，或工具，为了达到产生有效灭菌的正确温度和湿度，蒸汽渗透入包装是极其重要的。这包括高压仓内的前排空或在开始灭菌之前用蒸汽吹扫仓

内，因为蒸汽渗透是必需的，湿热灭菌后的无菌物品是湿的，需要干燥。如果是使用简单的灭菌锅或高压锅，就必须将消毒的物品放在烘箱或干燥架中。然而，大多数自动灭菌锅都有后排空(postvac)程序，能够使灭菌的物品在灭菌过程完成后是干燥的。显然，液体的灭菌不需要前排空和后排空，因为没有必要，还会使蒸发显著升高。
3. 射线灭菌
放射线(如γ射线，通常是60Co或135Cs)可用于消毒不耐热的物品，如塑料或热不稳定液体。由于需要相当高的剂量(25kGy)，一般要在中心设备中进行，它也能提供电子波灭菌。物品必须包装和密封，可使用聚乙烯包装，用热焊密封。
4. 化学灭菌
许多塑料器皿不能高压灭菌或干热灭菌，因为温度太高。这类器皿灭菌时，要先在70%乙醇中浸泡30min，然后放在层流洁净台内，在紫外线灯照射下晾干。在处理一些塑料器皿(如树脂玻璃、塑胶玻璃、透明合成树脂)时要特别小心，因为它们在乙醇中或暴露在紫外线灯下会解聚。乙烯氧化物可用于塑料器皿的灭菌，但是灭菌后需要2~3周才能将其从塑料表面全部清洗掉。还可使用其他化学灭菌剂，包括次氯酸钠和氯仿，但它们更多是作为消除污染的试剂(参见6.8.6节)而用于液体和塑料物品的灭菌。氯仿尤其难去除，通常仅用于熏蒸(参见6.8.7节)，而次氯酸盐可用无菌水有效去除，这取决于所使用产品的配方
5. 无菌指示器
无菌检测有3种需求∶①表明物品已经过灭菌程序;②证明物品已经历了所要求的温度、压力、湿度的处理;③确保无菌。针对第一项需求，通常使用灭菌显示胶带或标签，然而这些标识只能表明物品已经经历了灭菌过程，并不能证明它就是无菌的。这些指示器的主要功能是可以区分待消毒物品与已消毒物品。如果细心选择，第二种类型的指示器将表明物品已经历了正确的灭菌过程。Browne's试管或类似物，可以在灭菌温度达到适当的时间后发生颜色的改变，而其他指示器可以显示灭菌过程是在正确的温度、湿度下经历了正确的时间。然而，只有用细菌芽孢的杀菌测试条(MesaLaboratories)才能证实灭菌条件是正确的，因为杀死了芽孢达到了无菌。芽孢试纸条(MesaLaboratories)也用于一些工业及临床设施、工艺或设备的研发，但通常不用于学术或研究环境，此时第一种和第二种指示器结合使用就足够了。
然而，这些指示器都不能反映真实的结果，除非将它们置于设备中，一个最难灭菌的部位，即塞满了物品的灭菌锅的中央，这个位置就是放置记录式温度计探头的位置。也可根据灭菌锅内水的温度来判断温度，但这不能准确反映灭菌器内部当时的温度。记录型温度计的优点是可以得到并保存长期的温度记录，可以是数字式存档也可以纸质复制存档。另外，指示器提供了可视的温度和湿度，并且可同时监测样品的多个部分，实际操作时二者均可用。
6. 过滤除菌
不耐热的液体可采用微孔过滤器除菌。有正压过滤法，所用的滤器大小不同∶有13-mm注射器顶端式滤器，有总直径小于等于293mm的连线式多碟滤器，还有内部有许多皱褶、面积小于等于1000cm²的筒状滤器;还有负压过滤法，即将一个真空瓶与滤器相连。负压过滤虽然需要一个真空管或真空泵，却是一种简单有效的过滤方法，因为过滤后的液体可直接收集至瓶中储存起来。不过负压过滤会导致pH升高，因为溶解在培养基中的CO2会丢失，所以，瓶子在储存培养基前，可能需要充适当浓度的CO2气体。
过滤灭菌的程序需要做质控，通过发泡点试验确认滤膜的完整性，即确认滤膜在承受超过灭菌压力的情况下没有形成气泡，这时在湿滤膜的高压一侧只有空气。适当的无菌控制也包括确认膜是无菌的
仪器与设备的消毒

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