离线
导读
肝纤维化伴随着赖氨酰氧化酶的上调,其催化细胞外基质蛋白上的赖氨酸ε-氨基氧化形成含醛的氨基酸赖氨酸(LysAld)。近期,哈佛医学院的Peter Caravan教授课题组合理设计了具有高信号放大功能的新型锰基MRI探针,可用于肝纤维化的特异性靶向成像。探针Mn-2CHyd 在与LysAld反应时展现出优异的亲和力,同时开启4倍的弛豫。用[ 52 M n ]Mn-2CHyd 进行的动态PET-MRI研究显示,健康小鼠肝脏对探针的摄取较低。重要的是,在CCl4损伤的小鼠体内证明了探针特异性检测肝纤维化的能力。相关成果以“Dual Hydrazine-Equipped Turn-On Manganese-Based Probes for Magnetic Resonance Imaging of Liver Fibrogenesis”为题发表于J. Am. Chem. Soc. 。
正文
肝纤维化是由病毒性乙型或丙型肝炎感染、自身免疫和胆道疾病、酒精性和非酒精性脂肪性肝炎等引起的慢性炎症,是肝脏疾病发病率和死亡率的主要原因。纤维化的特点是细胞外基质(ECM)成分在肝脏中的逐渐积累,并且很有可能发展为肝硬化、肝细胞癌、肝功能衰竭或死亡,使其成为巨大的经济和社会负担。此外,晚期肝纤维化通常被认为是不可逆的,终末期肝硬化的唯一治愈方法是移植,这凸显了早期发现的必要性。活检是了解肝纤维化发作及其疾病活动性,和对肝纤维化严重程度进行病理分期的临床黄金准则;然而,活检是侵入性的,存在取样误差和并发症风险。缺乏检测和量化肝纤维化的非侵入性方法极大地阻碍了肝纤维化的诊断以及新疗法的开发。
在肝纤维化过程中,慢性肝损伤导致重塑ECM的肝星状细胞活化和增殖。赖氨酰氧化酶(LOX)酶家族的上调催化ECM(主要是胶原蛋白)上的赖氨酸ε-氨基氧化形成醛赖氨酸(LysAld),然后与其他蛋白质发生交联反应以稳定纤维化ECM。作者在前期工作中已经证明LysAld是纤维化发生的生物标志物,并且用肼官能团修饰的基于钆(Gd)的磁共振探针可以在体内与LysAld共价结合,以量化纤维化的发展。但是,人们对基于Gd的造影剂的长期安全性感到担忧。钆与肾源性系统性纤维化有关,这是一种潜在的致命疾病,伴有硬皮病样皮肤损伤,发生在肾功能降低的患者身上。
锰络合物是作为MRI造影剂的Gd3+络合物的有前途的替代品。而且,锰也是人体必需的元素,少量残留的锰可通过内源性机制加工清除。此外,Mn具有正电子发射断层扫描(PET)同位素52Mn,半衰期为5.6天,因此可以使用PET-MRI在几天内评估全身药代动力学。然而,由于缺乏配体场稳定能,Mn(II)配合物通常很不稳定,迄今为止,仅有有限的具有高热力学和动力学稳定性的Mn(II)配合物的报道。这是肝脏成像病理学的一个特殊挑战,因为游离Mn2+会被正常肝脏中的肝细胞大量吸收,从而导致高背景信号。因此,响应性和靶向性锰造影剂的设计更具挑战性。
作者认为用于肝纤维化成像的锰基MR探针必须满足几个要求:(1)不与LysAld结合时的弛豫低,以尽量减少背景信号;(2)与LysAld结合时具有高弛豫以增加纤维发生部位的信号;(3)高动力学惰性,防止游离Mn2+释放造成高肝脏背景信号;(4)完整配合物的最小肝胆消除,以最小化肝脏背景;(5)一种氧化还原稳定的Mn2+配合物,因为Mn3+可以氧化肼。基于这些设计要求,作者合理设计并合成了新型修饰肼官能团的锰基MRI探针,用于检测肝纤维化(图1)。
图 1. 用于靶向肝纤维化过程中LysAld的可逆双结合锰基MRI探针设计示意图(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)
首先,由于cis -Mn-1,4-DO2A 已经被证明具有抗氧化稳定性以及高热力学稳定性和动力学惰性,因此,作者设计了基于cis -Mn-1,4-DO2A 结构的双结合锰基探针(图 2)。这种双结合位点的设计方法能够有效提高LysAld的反应速率,并在结合时提供较大的弛豫开启,因为“双锁定”探针将减少蛋白质结合的Mn复合物的内部运动。因此,作者将两个哌嗪-肼或酰肼部分引入cis -Mn-1,4-DO2A 的骨架中以形成Mn(II)配合物Mn-2CHyd 和Mn-2Hyd 。此外,作者还合成了含有一个哌嗪-肼的对照探针Mn-1C h yd 。与酰肼相比,哌嗪-肼单元对LysAld具有更高的反应性和亲和力。接着,作者对探针的性能进行了表征。在循环伏安法实验中,Mn-2CHyd 在969 mV (Epa) 处显示出不可逆的MnII/MnIII峰和在731 mV处的配体氧化峰,表明Mn2+在Mn-2CHyd 中不易被氧化。然后,通过测量Zn2+存在下Mn2+配合物的纵向弛豫变化验证了探针对Mn2+释放的惰性。
图 2. 锰基MRI探针的结构及其性能表征(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)
然后,作者通过高效液相色谱结合电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP MS)比较了配合物与丁醛(一种LysAld的小分子模型)的反应性(图3)。结果显示,相应腙络合物的最快形成的是与Mn-2CHyd 形成的络合物,在pH 7.4下,转化率和缔合速率常数都比Mn-1CHyd 高2倍。与形成双腙产物的富电子烷基肼Mn-2CHyd 相比,带有Mn-2Hyd 的缺电子酰基肼90 min后转化率略低,并且没有形成相同反应条件下的双腙产物。Mn-2Hyd 的反应性在更酸性的条件下(pH 6.5)显著增加,这表明Mn-2Hyd 具有作为pH敏感的LysAld靶向探针的潜力。在所有反应过程中,均未检测到游离锰,进一步证明了配合物的稳定性。
图 3. 探针的响应性能测试(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)
接下来,作者验证了Mn(II)配合物与含有牛血清白蛋白(BSAAld)的LysAld的反应,以评估蛋白质结合的效果。结果显示,在BSA中,所有Mn(II)配合物的弛豫度与PBS中的类似,表明存在可忽略不计的非特异性结合。然而,在BSAAld中的弛豫度显著增加,Mn-2Hyd 、Mn-1CHyd 和Mn-2CHyd 分别增加了42%、37%和103%。作者通过分离BSAAld结合的物质进一步量化了结合产率和弛豫度。其中,Mn-2CHyd 在不同浓度下显示出最高的结合产率。相比之下,蛋白质结合的Mn-1C h yd 显示出较低的弛豫度,从而证明了双结合位点的设计方法在通过限制分子旋转来提高弛豫方面的有效性。
由于Mn-1CHyd 和Mn-2CHyd 在BSAAld中显示出比Mn-2Hyd 更高的反应性和弛豫性,作者进一步在体内测试了这两种复合物,并使用PET-MRI研究了它们在正常小鼠中的药代动力学(图4)。两种探针在静脉注射后从血液中快速消除,通过肾脏进入膀胱。然而,Mn-1CHyd 在MRI和PET中均显示出高度的肝脏信号增强,而随着时间的推移,Mn-2C H yd 的信号在健康肝脏中几乎没有增强。24 h后,与来自Mn-1CHyd 的Mn-52相比,来自Mn-2CHyd 的Mn-52在各个器官中的保留较低。这些研究表明,Mn-1CHyd 不适合肝脏的MR成像,因为它的肝脏摄取会产生高的非特异性信号。
图 4. 体内药代动力学实验(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)
接下来,作者测试了Mn-2CHyd 是否可以检测体内肝纤维化(图5)。首先,作者用CCl4对小鼠灌胃12周构建了肝纤维化模型。然后,在静脉注射Mn-2CHyd 或Gd-DOTA (阴性对照)后立即在小鼠中进行磁共振成像。相较于对照造影剂,在注射后45分钟,Mn-2CHyd 显示出比在健康小鼠中显著增强的肝脏MR信号以及更慢的肝脏清除率。这些数据表明,Mn-2CHyd 对肝纤维化的体内检测具有高度灵敏性和特异性。
图 5. 肝纤维化的体内检测(图片来源:J. Am. Chem. Soc.)
总结
哈佛医学院的Peter Caravan教授课题组合理设计了基于Mn2+的MR探针,其在正常小鼠肝脏中具有较低的信号,但和LysAld结合后开启4倍弛豫。探针检测肝纤维化的能力在体内得到证实,其中Mn-2CHyd 在纤维化小鼠中显示出比在健康小鼠中显著增强的肝脏MR信号,并且可以检测非特异性临床造影剂Gd-DOTA 无法检测到的病理。Mn配合物也可以用52Mn进行放射性标记,可以进行PET-MRI双模态成像分析。该工作有助于进一步开发和应用锰基MRI探针用于肝纤维化磁共振成像。
文献详情:
Yingying Ning, Iris Yuwen Zhou, Nicholas J. Rotile, Pamela Pantazopoulos, Huan Wang, Stephen Cole Barrett, Mozhdeh Sojoodi, Kenneth K. Tanabe, Peter Caravan*. Dual Hydrazine-Equipped Turn-On Manganese-Based Probes for Magnetic Resonance Imaging of Liver Fibrogenesis. J. Am. Chem. Soc. 2022. https://doi.org/10.1021/jacs.2c06231
来源:https://www.163.com/dy/article/HGDHOO5G0511CTRH.html
免责声明:如果侵犯了您的权益,请联系站长,我们会及时删除侵权内容,谢谢合作!