中国药科大学 发酵工艺学 发酵过程中的供氧

Struggle

发酵过程中的供氧
发酵产品大多是由需氧微生物和厌氧微生物产生的，大多数是由需氧微生物产生的。好氧微生物的生长和代谢需要消耗氧气，只有在有氧存在时才能完成生物氧化作用。氧气只有溶解到发酵液并进一步传递到细胞内的氧化酶系才能被利用。工业生产中通常不断地从发酵罐底部通入无菌空气以维持一定的溶氧浓度。
如果不连续向发酵液中供给氧气，菌体的呼吸就会受到强烈抑制。因此，在微生物的能量代谢活动中，氧的供给十分重要。生产水平的不断提高要求设备的供氧能力也要提高。
不同微生物对氧的需求不同：（1）好氧微生物只有在溶氧存在时，才能进行生长繁殖等代谢活动；（2）兼性厌氧微生物如酵母、乳酸菌等在有氧或无氧条件下均能生长，但代谢产物不同；（3）对于厌氧微生物而言，氧是一种有害物质，即使短时间接触空气也会抑制其生长甚至致死。
氧在微生物发酵中的作用：（1）氧是构成微生物细胞本身及其代谢产物组分之一；（2）作为中间体直接参与一些反应。
摄氧率：（r/OUR）单位体积发酵液每小时消耗氧的量。单位为mmol/（L.h）
呼吸强度（QO2）也称氧比消耗速率，即单位重量的菌体（折干）每小时消耗氧的量。r=QO2xX，X为发酵液中菌体浓度。
微生物的临界氧浓度：当溶解氧浓度较低时，呼吸强度随溶解氧浓度的增加而增加，当溶氧浓度达某一定值之后，呼吸强度不在随溶解氧浓度的增加而变化，此时的溶氧浓度称为呼吸临界氧浓度，以C临界表示。一般来说，在发酵过程中发酵液的溶氧浓度不低于呼吸临界氧浓度。
影响微生物呼吸玲姐氧浓度的主要因素：（1）微生物的种类和培养温度：不同的微生物其呼吸临界氧浓度不同，同一微生物在不同的培养温度下其呼吸临界氧浓度也不相同。（2）微生物的生长阶段C长临和C合临，根据菌种特性不同表现出不同的关系。（3）发酵液的理化性质及发酵罐的结构：牛顿流体：无影响，如细菌和酵母菌的培养液，黏度低。非牛顿流体：与搅拌器的直径和转速有关（放线菌、真菌培养液，黏度高）。
生长临界溶氧浓度不一定与产物合成临界溶氧浓度相同。临界溶氧浓度并不等于其最适生长氧浓度。在培养过程中并不是维持溶氧越高越好。过高的溶氧对其生长可能不利。
氧在液体中的溶解特性：氧溶解于水的过程是气体分子在水中的扩散过程。空气与与液体相接触，氧气分子就会溶解在液体之中，经过一定的接触时间，氧气分子在气液两相中的浓度就会达到动态平衡。饱和浓度C*。
影响溶解氧饱和浓度的主要因素：（1）温度：随着温度升高，气体分子运动加快，使溶液中溶解氧的饱和浓度下降。C*=14.68/（31.6+t）；（2）溶液的性质：溶质种类；溶质含量：溶质越多，氧的溶解度越低。（3）氧分压：气相中氧浓度增加，溶液中氧饱和浓度上升。
影响微生物需氧量的因素：（1）微生物种类和生长阶段：一般来说，微生物的细胞结构越简单，生长速度越快，单位时间内消耗的氧就越多。生长阶段：延迟期：菌体代谢不活跃，需氧量较低；进入对数生长期，菌体代谢旺盛，呼吸强度高，需氧量随之增加；到了稳定期，需氧量不在增加。生长后期，由于菌体衰老，呼吸强度减弱，溶氧也会逐步上升，菌体一旦自溶，溶氧更会明显上升。
菌体生长期的摄氧率大于产物合成期的摄氧率。因此认为培养液的摄氧率达最高值时，培养液中菌体浓度也达到了最大值。
（2）培养基的组成：碳源物质分解利用与氧化过程密切相关。碳源物质经过有氧氧化最后被氧化成二氧化碳，水并放出能量。在补料分批发酵过程中，微生物的需氧量随补入的碳源浓度而变化，一般补料后，摄氧率有不同程度的增大。易被微生物分解利用的碳源，消耗的氧就比较多。
（3）培养液中溶氧浓度CL的影响：CL>C长临时，菌体呼吸不受影响。CL<C长临或C合临，受影响，严重时会产生不可逆的抑制菌体生长和产物合成的现象。；
（4）培养条件：温度越适合生长，营养成分越丰富，其呼吸强度的临界值也相应地增长，最适ph也是如此。
（5）二氧化碳的影响：二氧化碳如果不及时从发酵液中除去，势必影响菌体呼吸，进而影响菌体代谢活动。影响溶氧，影响ph。及时排除有毒代谢产物如挥发性的有机酸和过量的氨，也有利于提高菌体的摄氧量。
供氧方面的阻力：（1）气膜阻力：气体穿越气液界面的气膜阻力，与空气情况有关；（2）气液界面阻力：只有具备高能量的氧分子才能透到液相中去，而其他的则返回气相，与空气情况有关；（2）液膜阻力：从气液界面至液体液膜阻力，与发酵液的成分和浓度有关；（4）液流阻力：液体主流中传递到阻力；与发酵液的成分和浓度有关。
耗氧方面的阻力：（1）菌丝团周围液膜阻力；（2）菌丝丛菌丝团内的扩散阻力。（3）细胞膜的阻力；（4）细胞呼吸酶与氧反应阻力。
影响阻力的限制因素：供氧方面的液膜阻力是氧溶于水时的限制因素。搅拌以解决。
细胞内反应阻力：培养基成分与其相应的酶的作用失活；一些生理条件不适合酶的反应，一些代谢物的积累或不能及时从反应处移去。
氧传递方程式：N=KLa*（C*－CL）。总需氧速率：（溶解氧浓度不是菌体生长和产物合成的限制因素时：N=QO2*X=r。
影响氧传递推动力的因素：（1）降低CL，一般不可取；（2）提高C*：降低培养温度；降低培养基中营养物质含量（加无菌水）；提高氧分压：提高罐压，采用富氧空气。局限：（1）发酵温度是依微生物生理特征确定的，再降低温度的可能性较小。（2）提高罐压会减小气泡体积，减少了气液接触面积，影响氧的传递速率，降低氧的溶解度，影响菌体的呼吸强度，同时增加对设备的耐压负担。同时二氧化碳的溶解度会剧烈增加。通入纯氧成本高，有危险，还可能出现微生物中毒的情况。（3）发酵培养基的组成是根据生产菌种大胜利特性和生物合成代谢产物需要确定的，一般不能随意改动，但在发酵的中后期，发酵液粘度太大，可通过补水降低发酵液粘度，改善供氧效率。
降低CL：减少通气量，降低搅拌转速。但不能低于C临界。
KLa：氧传递系数*比表面积。液相体积氧传递系数，影响因素：（1）搅拌功率、空气流速、发酵液的物理性质、泡沫状态、空气分布器性状和发酵罐结构。
搅拌功率的影响：
搅拌的作用：（1）使搅拌罐内的温度和营养物质达到均一，使组成发酵液的三相系统充分混合；（2）把引入发酵液的空气分散成小炮，增加气液传质面积，提高KLA值；（3）增强发酵液的湍流程度，降低气泡周围的液膜厚度和流体扩散阻力，从而提高氧的传递速率；（4）减少菌丝结团，降低菌丝丛内扩散阻力和菌丝丛周围的液膜阻力；（5）可延长空气气泡在发酵罐中的停留时间，增加氧的溶解量。
影响搅拌功率的因素：当液体处于湍流状态时，单位体积发酵液所消耗的搅拌功率才能作为衡量搅拌程度的可靠指标。影响因素：密度，转速，是否通气，黏度；通气情况下搅拌功率仅为不通气时所消耗功率的30－60%。
搅拌功率对KLA的影响：搅拌器直径，转速的增加都会引起搅拌功率的增加，KLA也相应增加。工业上发酵设备的尺寸基本固定，一般通过提高搅拌转速的方式来增加发酵液中的溶氧浓度。但也不能太快，否则可能对菌丝体造成一定损伤。
空气流速的影响：
对KLA的影响：正相关；随空气流速增加，由于发酵液中空气增多，相对密度下降，使得搅拌功率也下降。当空气流速增加到某一值时，由于空气流量过大，通入的空气不经搅拌叶的分散，而沿着搅拌轴形成空气通道，空气直接逸出发酵罐，此时搅拌功率不再下降，此时的空气流速称为“气泛点”，此时KLA也不再增加。
通用式机械搅拌发酵罐中的无圆盘的开放式搅拌器易产生气泛现象，故要加一个圆盘
空气流量应控制在使搅拌轴附近的液面没有大的气泡逸出。
搅拌与通气对KLA的比较：搅拌功率对发酵产量低影响远大于空气流速。要提高设备的供氧能力，采用提高搅拌功率，适当降低空气流速，是一种有效的办法。
发酵液理化性质的影响：KLA与发酵液的表观黏度成反比，是主要影响因素之一。发酵液由营养物质、生长的菌体细胞核代谢产物组成的。由于微生物的生长和多种代谢作用使发酵液的组成不断地发生变化，营养物质的消耗、菌体浓度、菌丝形态和某种代谢产物的合成都能引起发酵液粘度的变化，因而显著影响氧的传递效率。发酵液中菌体浓度和形态对黏度有较大的影响。细菌和酵母发酵时黏度较小、霉菌和放线菌发酵时，随着菌浓的增加，发酵液的黏度也增加。
加糖，花生饼粉等有机物质会降低KLA，某些少量的醇或酮和酯会增加KLA；加电解质，KLA升高；加消泡剂，增加。
向培养液中加入分散的有机相可以减少氧的传递阻力，增加KLA。这种有机相称为氧载体。
泡沫对KLA的影响：在发酵过程中，由于通气和搅拌的作用常引起发酵液出现泡沫。在粘稠的发酵液中形成等流态泡沫比较难以消除，影响气体的交换和传递。如果搅拌叶轮处于泡沫的包围之中，也会影响气体与液体的充分混合，降低氧的传递速率。消泡剂过多还会聚集在细胞周围，阻碍细胞对氧和营养物质的吸收。
空气分布器形式和发酵罐结构的影响：鼓泡器也可分散空气，提高通气效率，增加高径比，可增加空气在管内停留时间，使用多组搅拌器，搅拌器出于合适的位置。
溶解氧浓度的测定：（1）亚硫酸钠测定法，属于离线测定法。（2）溶氧电极：1，覆膜溶解氧电极：用能透过氧分子的薄膜将电极系统与被测定溶液分隔开来。分为极谱型溶氧电极和原电池型。覆膜型溶解氧电极经长时间高温灭菌和发酵使用后漂移较大，容易造成测量误差。成本高，维护复杂。
溶解氧电极的标定：（1）饱和电流值的测定：纯水在一定温度和大气压下，其溶解氧饱和浓度时一定数值。（2）残余电流值的测定：将饱和亚硫酸钠溶液中的溶解氧浓度看做0，插入后，测得此时电流为I残，表示溶解氧浓度为0时的电流值。（3）溶解氧的标定；（4）溶解氧的测定。（5）相对溶解氧浓度的测定：灭菌后未接种培养基的发酵液溶氧浓度定为100%，接种后溶氧浓度下降，发酵过程中溶氧电极所指示溶解氧浓度即为相对溶解氧浓度，以百分数表示。实际发酵生产中常常使用相对溶解氧浓度来表示。
停气测定法：一个电极就可以完成，但需要停气。适用于测定实验发酵罐的摄氧率（1）发酵某一时间，测定溶氧浓度，电流为I1。（2）关闭通气阀门，记下时间t1，保持搅拌，从罐顶通入氮气，将罐内空气排出发酵罐，此时由于菌体耗氧，培养液中的溶氧浓度不断下降，电流值也不断下降。（3）下降到最低点时记下t2和I2。（4）计算得到的是单位时间内溶氧浓度的变化值。


不停气测定法：需要测定发酵罐尾气中的氧气含量，同时需要测定通入发酵罐的空气流量。摄氧率=（单位时间内通入发酵罐中氧气的量－单位时间由发酵罐排出氧气的量）/发酵液的体积。
KLA的测定：KLA=r/（C*－CL），有动态测定法、直接测定法、亚硫酸盐测定法、生物酶氧化法等。（1）动态测定法：与停气法相同。（2）直接测定法。

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